什么樣的進階武器，會有那么大威力？

CUT&Tag——ChIP-Seq進階武器
 
一、染色質免疫沉淀后測序（ChIP-Seq）
ChIP-Seq是一種針對DNA結合蛋白、組蛋白修飾或者核小體的全基因組測序分析技術。其基本原理是利用甲醛處理細胞，使目標蛋白與DNA交聯，通過超聲破碎將交聯后的染色質打碎成小片段，一般在200-600bp。再利用抗原-抗體特異性識別反應，將目的蛋白連同交聯的DNA片段一起沉淀下來。洗脫蛋白質沉淀，對純化后的DNA進行PCR擴增，高通量測序，最后與已有的基因組序列進行比對，以確定與目的蛋白交聯的DNA的序列。
ChIP-Seq可以完整的反映與靶蛋白結合的DNA序列，是蛋白質與DNA互作的經典方法。但是常規的ChIP-Seq需要大量的細胞樣本，而且對培養環境、處理條件要求較高，且實驗重復性較差、信噪比低。很多時候會發現，培養了很長周期的細胞，經過ChIP-Seq測序后得到的卻是大量的垃圾數據，這些限制了ChIP-Seq的應用，亟需進化升級。
二、CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagment）技術
2019年4月底，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士，在Nature Communication雜質上公開了CUT&Tag技術的詳細結果和實驗方案。能在全基因層面上檢測與組蛋白、轉錄因子等相互作用的DNA片段。這種方法相較于ChIP-Seq、pA-MNase等方法，更加簡便，信噪比更高、重復性更好、需要的細胞數量更少，切有希望將蛋白質-DNA結合研究做到單細胞水平。
CUT&Tag方法是Active motif專利技術TAM-ChIP技術的一個變形。CUT&Tag是基于ChIP原理的一項技術，與ChIP的免疫沉淀步驟相比，同樣是利用抗原抗體結合，但是CUT&Tag是抗體孵育后直接剪切染色質和制備文庫。
在CUT&Tag實驗中，細胞首先要經過透化處理，并將其與刀豆蛋白A一起孵育，以便于后續清洗步驟。細胞隨后先后與特異性抗體（一抗、二抗）孵育；然后將細胞與轉座體孵育，轉座體由帶有NGS接頭（adaptor）的Tn5轉座酶和蛋白A（protein A）融合而成。清洗掉未結合的轉座體。Tn5轉座酶是Mg²⁺依賴的酶，因此需要加入Mg²⁺以激活反應，從而使染色質被切割到接近蛋白結合位點的位置，同時鏈接上NGS測序接頭DNA序列。這使得染色質裂解和文庫制備只需一步完成。
 
 
 
三、
CUT&Tag具體實驗方案
1. 細胞預處理（0.5-1h）
1) 室溫下收集新鮮細胞置于EP管中并計數；低速離心，去溶液；
2) 管中加入細胞穿孔緩沖液重懸細胞；低速離心，去溶液；
3）管中加入細胞穿孔緩沖液再重懸細胞，輕柔震蕩并滴加Binding 緩沖液重懸的ConA磁珠，輕柔顛倒混勻5-10min；
2. 一抗結合目的蛋白（2h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架上沉淀細胞，去溶液。
2) EP管中加入預冷的抗體緩沖液將細胞重懸，輕柔震蕩后置于冰上;
3) 每管中加入0.5-1μl一抗（抗體使用生產商推薦濃度），輕柔震蕩；
4) 室溫下將EP管置于搖床上孵育2h；
3. 二抗結合一抗（1h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
2) 將二抗1:100稀釋于穿孔緩沖液，加入管中，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育30-60min；
4) 快速離心細胞，將管蓋液體離心下來，EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml 穿孔緩沖液，上下顛倒10次；
6) 重復步驟4)、5) 兩次。
4. ChiTag轉座體結合抗體（1.5h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
2) 將ChiTag轉座體1:250稀釋于穿孔緩沖液2中，并滴加于細胞上，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育1h；
4) 快速離心細胞，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml穿孔緩沖液2，上下顛倒10次；
6) 重復步驟4)、5) 兩次。
5. 激活ChiTag轉座體，片段化目的DNA（1h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
2) 管中加入300μl ChiTag激活緩沖液，輕柔震蕩；
3) 37ºC孵育1h。
6. DNA提取（1h）
7. PCR（1h），PCR之前需加入72ºC，5min步驟
8. DNA純化（30min）
9. 上機測序
具體時間、轉速需要根據不同的樣本、不同的研究目的進行優化。
 
 
 
四、CUT&Tag的局限性
1. CUT&Tag的自然狀態并不適合所有研究
未經固定的細胞不適用CUT&Tag。在CUT&Tag最初的文章中，此技術只用于組蛋白修飾、NPAT、CTCF。許多轉錄因子并不大量表達，且與DNA結合是微弱的、瞬時的，甚至有時候是間接的與染色質結合。對于這些情況，染色質交聯和超聲處理是檢測蛋白質-DNA相互作用的必要步驟。
大多數ChIP級別抗體，經驗證可用于交聯條件下，然而無法在自然情況下具有好的作用，因為交聯條件下的蛋白質表位可能不同于自然狀態下的蛋白質表位。因此從X-ChIP轉到CUT&Tag需要進行抗體驗證，以確定抗體在不固定的條件下的特異性和敏感性。
2. CUT&Tag可能引入偏差
用于CUT&Tag的Tn5轉座酶對開放染色質區域具有高度親和性。因此，CUT&Tag可能優先適用于分析組蛋白修飾或與基因組活躍轉錄區域相關轉錄因子，而不是非常適合于沉默或含有異染色質的基因組區域。消化時間和pA-Tn5使用量需要每個目標仔細優化，以避免任何不特異的轉座反應。
3. CUT&Tag技術還太新
雖然CUT&Tag已經出現了有一段時間了，且很快就流行了起來。但是在2019年4月才首次發表詳細的實驗方案。因此，在同行評議中并沒有很多包含CUT&Tag結果的數據出現。另外，CUT&Tag實驗流程與ChIP-Seq相差很大，兩者的數據對比也比較困難，