腫瘤駐留的細胞內微生物群促進乳腺癌轉移定植

宿主微生物群，作為不可忽視的身體成分，是調節癌癥易感性和腫瘤進展的重要媒介，除了眾所周知的遺傳、表觀遺傳和基質微環境因素。這些微生物主要通過間接途徑(包括代謝物和免疫系統)對遠端或近端腫瘤組織發揮作用，特別是在與腸道微生物群密切接觸的結直腸癌中。然而，近年來，有新的證據表明，微生物也是腫瘤組織本身的組成部分，在更廣泛的癌癥類型中，除了結直腸癌，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌等，最初認為這些癌癥是無菌的。臨床研究表明，組織駐留的微生物群特征與癌癥風險、病理類型、癌癥預后和治療反應。使用患者來源的異種移植(PDX)模型的研究表明，在免疫缺陷小鼠中，腫瘤內微生物群可以隨著腫瘤進展而持續存在。通過尾靜脈給藥外源性細菌會損害腫瘤的化療敏感性并促進腫瘤進展。
盡管越來越多的證據表明腫瘤內微生物群的重要性，但低生物量腫瘤微生物群在其生理穩態狀態下是否在腫瘤自發發展中發揮重要的生物學作用仍是一個懸而未決的問題。一個能夠再現人類腫瘤微生物群的動物自發腫瘤模型將極大地推動腫瘤常駐微生物群的功能研究，并闡明其在腫瘤進展中的意義。
近日，發表在《Cell》上的一篇研究通過使用小鼠自發乳腺腫瘤模型MMTV-PyMT來探討這些腫瘤內細菌的功能意義。研究發現發現，在不影響原發腫瘤生長的情況下，去除腫瘤內細菌可以顯著減少肺轉移。在轉移定植過程中，循環腫瘤細胞攜帶的腫瘤內細菌通過重組肌動蛋白細胞骨架增強了宿主細胞對流體剪切應力的抵抗力，從而促進了宿主細胞的生存。研究進一步發現，在兩種具有顯著不同轉移潛能水平的小鼠腫瘤模型中，腫瘤內注射從腫瘤駐留菌群中分離出來的選定細菌菌株可促進腫瘤轉移。研究結果表明，腫瘤駐留菌群雖然生物量較低，但在促進腫瘤轉移方面發揮了重要作用，因此，對其干預可能值得探索，以促進腫瘤護理。
 
自發小鼠BT含有大量的活細菌
研究人員通過16S測序全面描述組織駐留菌群的組成。對16S文庫構建流程進行了優化，通過添加生物素富集步驟來減少非特異性基因組序列，比傳統方法檢測腸道菌群的靈敏度顯著提高。據此，研究分析了正常組織和腫瘤組織中的微生物群(圖1)。無監督聚類分析顯示，對照(NTC和EBC)、正常乳腺組織和BT組織具有明顯的微生物群落(圖1I)。陰性對照樣品中大部分微生物為變形菌門(Proteobacteria，圖1G和S1I)，而組織樣品富集為厚壁菌門(Firmicutes，圖1G)。研究數據共同表明PyMT自發性腫瘤中含有大量的活菌。

圖1所示。微生物群是MMTV-PyMT自發乳腺腫瘤的重要組成部分
 
 
圖S1。在門和屬水平上優化EBC對照組、正常乳腺和乳腺腫瘤組織常駐菌群分析及菌群相對豐度，與圖1和STAR方法相關
 
清除腫瘤內的微生物會阻礙腫瘤的轉移，但不會阻礙原發腫瘤的生長
通過測試不同的抗生素組合和給藥途徑來選擇性地消除腫瘤駐留或腸道微生物群(圖3A)。研究發現使用雞尾酒抗生素(ATBx)，通過飲用水(DW)可以有效清除腸道和腫瘤微生物菌群。當ATBx經尾靜脈靜脈注射時，腫瘤菌群被清除，而腸道菌群保持完整(圖3B和3C)。通過DW給藥穿透細胞膜的抗生素多西環素具有與ATBx-IV相似的效果(圖3B和3C)。最重要的是，ATBx-IV和Dox-DW處理在腸道活菌數量、腸道微生物群譜和腫瘤免疫譜方面與對照組保持相當(圖S3A S3D和S3F S3I)。結果發現ATBx-DW能有效地減緩自發MMTV-PyMT BTs的腫瘤生長(總腫瘤重量為15±對照組為0.5g，而ATBx-DW為11±0.8g)，而單獨用ATBx-IV或Dox-DW消除腫瘤微生物群并不影響腫瘤總重量(圖3D)。這表明腸道菌群在腫瘤生長中起著重要作用，而腫瘤菌群則不然。

圖3。腫瘤駐留菌群是PyMT腫瘤自發轉移的必要條件
 
圖S3。抗生素對PyMT腫瘤的治療效果與腸道微生物群有關
 
在MMTV-PyMT腫瘤發展的晚期，大多數荷瘤小鼠發生肺轉移。研究者發現原發腫瘤中微生物群的存在與肺轉移的存在相關性較弱;細胞內細菌數量與細胞內細菌數量呈較強的線性相關 (圖3 e)。這提示細胞內的微生物群可能參與了腫瘤的轉移。由于ATBx-DW既消除了腸道菌群，也消除了腫瘤菌群，因此ATBx-DW在降低腫瘤總重量的同時也表現出抑制腫瘤轉移的作用(圖3F)。這些數據共同表明，腫瘤內細菌在PyMT BT轉移中是必不可少的。
 
為了可視化腫瘤轉移過程中微生物群的動態變化，研究人員繪制了不同樣本中不同細菌屬的豐度，以NB、BT、MAL、LM的順序作為腫瘤進展的指示。有趣的是，無監督聚類將細菌分為具有不同動態模式的四類(圖4H和4I)。顯性聚類增加了乳腺組織中的豐度，微轉移持續，大轉移減少(圖4H和4I)。
為了進一步驗證細菌可以與腫瘤細胞一起在循環系統中傳播的假設，研究人員將紅霉素耐藥元件- gfp (erm-GFP)植入木糖鏈球菌基因組中，以在空間和時間上追蹤細菌(圖4J)。結果表明，細菌可以，但只能與腫瘤細胞一起，通過循環系統，并在遠端器官定植。

圖 4.PyMT腫瘤細胞在轉移過程中攜帶微生物群
 
某些細胞內細菌促進轉移定植
為了探究單個菌株的侵襲是否對腫瘤細胞在轉移過程中的定植有任何作用，研究者通過尾靜脈將四種菌株侵襲的腫瘤類器官注射回小鼠體內，并利用組織清查成像技術對轉移定植情況進行分析。體外和體內功能測試表明，在不同的腫瘤遺傳小鼠模型中，細菌的入侵可以功能性地促進BT的轉移。
 
研究對從類器官培養中分離的細菌入侵癌細胞進行單細胞RNAseq分析(圖6A)。 KEGG通路分析顯示，被細菌入侵的腫瘤細胞開啟了許多免疫相關信號，包括toll樣受體信號通路、nod樣受體信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、Th17信號通路、細胞因子趨化因子相關通路等(圖6C)。有趣的是，研究發現木糖擬南芥、動物擬南芥、兔丘擬南芥和馬血擬南芥對腫瘤細胞的侵襲特異性地觸發了流體剪切應力途徑。
 
通過建立了一個循環系統與蠕動泵來模擬流體剪切應力的血管(圖6 d)。這種表型表明細菌可能在肌動蛋白細胞骨架的組織中發揮作用。。
為了測試細菌誘導的收縮力的緩解是否有利于循環腫瘤細胞在體內血流剪切力下的存活，研究者通過尾靜脈將細菌相關的癌細胞靜脈注射回免疫缺陷的NPSG小鼠，以避免免疫系統的間接影響(圖6)。結果發現木糖擬南芥、動物擬南芥和小囊擬南芥能顯著提高肺癌細胞的存活率，分別為6.4倍、5.0倍和3.4倍(圖6N和6O)。

圖 6.細胞內微生物群重組細胞骨架并促進對機械應力的抵抗力
 
人類BT保守菌群圖譜
在人類乳腺癌中，原發腫瘤和轉移部位之間的微生物群聯系尚不清楚。通過采集伴有配對腫瘤相鄰正常乳腺組織和淋巴結轉移的人BT組織，通過16S測序分析其微生物菌群組成。這些數據表明，小鼠BT和人類BT具有相似的微生物群落結構和動態，表明人類BT的微生物群可能在人類癌癥的發病和發展中發揮保守的作用。

圖7。人乳腺癌原發部位與淋巴結轉移有相關性