脊柱“緩震器”磨損何解？中國繪首份椎間盤單細胞圖譜

       人類有23個椎間盤（IVD），其厚度約占骶椎以上脊柱全長的1/4。這些椎間盤被稱為是脊柱“緩震器”，但它們的磨損卻可能從20歲就開始，隨著年齡的增長，磨損日益嚴重，由此導致所謂的椎間盤退行性疾病 (DDD)。

       “椎間盤退行性疾病是與椎間盤退變相關的一大類疾病的統稱，包括大眾所熟知的頸椎病、腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥等。”近日，陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心（大坪醫院）骨科主任、外科學與野戰外科學教研室主任劉鵬教授在接受澎湃新聞（www.thepaper.cn）記者采訪時表示，“在年齡增長、反復及多次應力作用等綜合因素影響下，椎間盤三個組成部分會不同程度的發生老化，專業描述稱之為‘退行性變’。”值得注意的是，這類退行性疾病目前在醫學上尚未有“治本”的手段，劉鵬團隊聯合解放軍總醫院第五醫學中心劉兵研究員團隊，近年來“從零”開始探索。日前，Bone Research雜志以封面形式在線發表了劉鵬等人的一項研究，題為“Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs（空間解析單細胞轉錄譜表征人類椎間盤不同的軟骨細胞亞型和髓核祖細胞）”。

       “我們的研究策略是從健康椎間盤獲得了十萬個細胞，逐個進行測序，再整合起來進行生物信息學分析，這種技術叫做單細胞轉錄組測序。最終，我們在世界上首次系統繪制了含有空間信息的人類椎間盤單細胞圖譜，更新了人類對椎間盤細胞組成的認知。”

       劉鵬認為，更重要的是，這項研究從轉錄組和功能學層面鑒定得到一群新型的髓核祖細胞（NPPC），“這種細胞被證明具有干細胞的特征，具有再生的潛能，為建立椎間盤退行性疾病的生物治療策略提供了重要線索。”

       劉鵬和劉兵為該研究的共同通訊作者，陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心（大坪醫院）骨科甘翼搏博士后與軍事科學院軍事醫學研究院蛋白質組學國家重點實驗室賀健博士為共同第一作者，陸軍特色醫學中心為第一完成單位。該研究工作得到了陸軍特色醫學中心軍事醫學培養計劃、國家自然科學基金委、重慶市博新計劃、創傷燒傷與復合傷國家重點實驗室多個基金項目的資助。

       “治標”第一步：繪制人類椎間盤單細胞圖譜

       在過去的研究中，科學家不斷探索椎間盤生理學和病理學機制，尋求重建椎間盤穩態的創新治療方法。然而，椎間盤細胞的異質性以及分子特征的復雜性為退變生理病理機制的探索帶來了重大挑戰。

       “椎間盤是連接椎體最關鍵的結構，它由軟骨終板、纖維環和髓核三部分組成，其生理作用是維持椎體之間的連接、運動并吸收震蕩，可以將之視為脊柱的‘緩震器’。”劉鵬提到，雖然椎間盤退行性疾病是人體衰老的一部分，但是對健康造成的影響是巨大的，最常見的就是頸肩痛和腰腿痛。

       現有的治療方法主要分為保守治療與手術治療。保守治療手段包括休息、藥物和物理治療等；而手術治療以髓核摘除、神經組織減壓為主要手段，可根據情況決定是否同時實施脊柱融合術。

       “總體而言，目前治療方法的臨床效果是滿意的，但是深入分析其治療原理可知，目前療法均以緩解癥狀為主要目的，也就是老百姓俗稱的‘治標’，并沒有做到真正減緩、阻止或者逆轉‘椎間盤退變’這一核心病理改變。”劉鵬表示，多年來，學者們共同希望能夠探索新的生物學治療方法，以期徹底根治椎間盤退行性疾病，力爭做到“治本”。

       實際上，既往的研究發現，人類椎間盤內有很多不同類型的細胞成分。而人類椎間盤的細胞多樣性也與多種未知功能有關。例如，椎間盤干細胞可能在椎間盤發育、損傷和修復過程中發揮關鍵作用。但到，由于技術手段受限，迄今為止仍難以精確解析人類椎間盤內各細胞亞群的分子特征，起源及其調控機制。人類椎間盤的單細胞轉錄組全景圖。

       在劉鵬等人的這項最新研究中，研究人員從13-31周歲的研究人群中獲得健康椎間盤（Pfirrmann I級），從中分離髓核、纖維環和終板組織，最終對108108個椎間盤髓核、纖維環及終板組織的細胞進行了單細胞轉錄組測序和分析。

       研究團隊通過整合分析鑒定得到以下主要細胞亞群：3群軟骨細胞亞群、脊索細胞、基質細胞、周細胞、內皮細胞、髓核祖細胞，血細胞，成骨細胞以及少量的神經細胞。

       隨后，研究人員還根據細胞外基質（ECM）穩態的特征差異，將3群軟骨細胞進行了重新分類，進一步鑒定為調控型、穩態型和效應型。研究認為，調控型軟骨細胞主要在細胞因子表達和軟骨生成相關調控通路中發揮調控作用；穩態型軟骨細胞亞群相對靜息并且分化完全，與基質合成和節律調節相關；效應型軟骨型細胞具有較高代謝活性特征。

      研究認為，這些軟骨細胞亞群在胞外基質特征的差異，為進一步探索軟骨細胞維持椎間盤穩態的機制提供了一個新的視角。髓核祖細胞（NPPC）的特征和功能鑒定。

      研究還發現，髓核祖細胞亞群特異性高表達間充質祖細胞標記物PDGFRA和中胚層來源間充質標志物PRRX1，提示髓核內可能存在具有干性潛能的細胞群體。進一步分析發現部分髓核祖細胞亞群高表達干性基因PROCR，和軟骨生成相關的重要轉錄因子SMAD3，同時運應免疫熒光染色證實了PROCR+細胞內p-SMAD3高度活化。

       隨后，研究人員利用PROCR富集分選了髓核祖細胞群體，并發現該細胞群具有較強的體外克隆形成能力。最后，與擬時序分析一致，體外實驗證實PROCR+細胞具有成骨、成軟骨和成脂三系分化能力。

       劉鵬表示，“我們這項研究的初心，旨在以人體的最基本結構，也就是細胞為尺度，來研究椎間盤的細胞構成和細胞微環境。”

       他總結道，總的來說，他們這項研究發現椎間盤內部有多種功能各異的軟骨細胞，根據其功能進行了全新分類；更重要的是，發現了一種新型的髓核祖細胞，這種細胞被證明具有干細胞的特征，具有再生的潛能。“我們的研究是國際上首次在單細胞水平上對人類椎間盤的系統研究，對于人類認識椎間盤、治療椎間盤退行性疾病有重要的意義。”研究模式圖。

       逆轉退變，再生一個椎間盤？

       值得注意的是，目前椎間盤研究領域主要聚焦有兩個大方向：一是椎間盤退變病理機制研究，二是治療策略研究。

       劉鵬等人的研究并不屬于這兩個熱門方向，但其認為，“卻對這兩個熱門方向都有重要的啟示意義。”他認為，研究椎間盤在生理狀態下的細胞成分和細胞微環境構成，是從最底層來解析椎間盤的基本構成與功能。這一單細胞圖譜或將為理解椎間盤病理改變、治療椎間盤退行性疾病提供了重要的線索寶庫。

       就劉鵬課題組而言，他們一直夢想著用類器官構建的方法來嘗試解決退行性椎間盤疾病。一般來說，人類在從20-25歲開始，脊柱就開始退化。當然，我們通常不會看到年輕人頻繁背痛，椎間盤需要較長的磨損時間。此外，正常衰老也不是椎間盤退變的唯一原因，其他原因也會導致。

       “眾所周知，利用組織工程技術，已經可以制造一個人工的、鮮活的鼻子或者耳朵，用于器官缺損修復與整形手術。我們則希望用類似的方法來替換已經發生病變的椎間盤，或者使用生物學技術來逆轉椎間盤退變。”劉鵬將之稱為“椎間盤再生醫學”。

       然而，長期存在的爭論的是，什么樣的細胞可以再生一個椎間盤出來？“我們一直相信最有潛力的細胞就在椎間盤內部。”

       劉鵬強調，這項研究也初步驗證了他們的猜想，“發現了一群稀有細胞，它有一些干細胞的標志基因，我們將之稱為髓核祖細胞。髓核組細胞不但有良好的成克隆能力，還能分化成為骨、軟骨細胞。進一步應用生物信息學技術分析發現，血小板生長因子和轉化生長因子具有促進髓核祖細胞增殖和軟骨形成的作用。”

       劉鵬認為，所有這些結果提示，合理地運用細胞因子，有望用髓核祖細胞來實現椎間盤髓核的再生修復。

       在前期的這些研究中，劉鵬等人建立了健康椎間盤的單細胞轉錄組數據庫，但是這些信息仍然僅是冰山一角。“我們現在把這個數據庫共享給全世界同行，希望與同行共同努力，深入理解椎間盤的細胞構成、功能與細胞間相互作用，深入探索椎間盤退行性疾病的生物學治療策略與手段。”

       他們最終希望，能在現有“治標”的基礎上做到“治本”。

       論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41413-021-00163-z

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